Выделяют 2 этапа: приготовление материала и окрашивание мазка.
Приготовление материла для цитологического исследования
Прямой стандартный мазок: основной объект изучения цитологической картины, приготавливае-мый с помощью размазывания образца. Используют предметные стекла со шлифованным концом.
1. Мазок начинается на расстоянии 1 -1.5 см от узкого края предметного стекла и заканчивается на расстоянии 2-2.5 см от другого края предметного стекла. При исследовании жидкого материала мазок из осадка должен заканчиваться у узкого края предметного стекла в виде «зубчатого» следа.
2. Мазок должен быть максимально тонким (приближающимся к однослойному), равномерной толщины на всем протяжении. При приготовлении мазка нейлоновую щетку надо больше вращать, чем «тереть».
3. Мазок не должен достигать длинного края предметного стекла на расстояние 0.2-0.3 см. При невыполнении условий приготовления мазка получают толстый неравномерный мазок, содержащий недоступные детальному изучению («непросматриваемые») грубые скопления или комплексы клеток. В таком мазке трудно оценить результат иммуноцитохимического исследования из-за травмы клеток, присущей самой методике приготовления.
Препараты цитоспина: один из лучших методов для цитохимического и иммуноцитохимического исследования, т.к. получают монослойный мазок.
Клеточные блоки: приготовленные из материала ЖКТ сравнимы с мини-биопсией и оптимальны для любых специальных и иммуноцитохимических исследований. Клеточные блоки рекомендуют, если ткань плотна и из нее трудно приготовить стандартные мазки (рубец, организующаяся гранулема и т.д.); в них легко сравнивать последовательно проведенные исследования. Рутинно окрашенный срез из клеточного блока дает информацию о гистологическом строении опухоли. В таких случаях материал помещают в кассету, фиксируют в формалине и приготавливают гистологические срезы. Неокрашенные срезы, фиксированные в спирте, используют для иммуноцитохимического исследования.
Метод жидкостной цитологии (монослой). Новая современная методика, особенно адекватна для проведения иммуноцитохимических исследований (монослой и чистый фон; препараты можно не окрашивать, оставляя для отсроченного исследования).
Окрашивание мазка
Интерпретация рутинно окрашенных мазков является основой цитологического анализа. Обычно применяют высушенные на воздухе мазки, окрашенные азуром-эозином, и влажно фиксированные мазки, окрашенные гематоксилином-эозином или по Папаниколау. Приготовленные мазки вначале фиксируют, причем выбранная методика окрашивания мазка предопределяет способ фиксации материала. Нарушение методики фиксации ведет к некачественному окрашиванию мазка. Стандартная фиксация подразумевает использование 95 %-го этанола (3-10 минут); она позволяет избежать артифициальных изменений, связанных с высыханием мазка.
После высушивания мазка на воздухе чаще применяют более простую и более быструю окраску азуром-эозином, реже — окрашивание по Папани-колау или гематоксилином-эозином (краситель для патогистологических исследований) после влажной фиксации. При окрашивании необходимо соблюдать стандарты состава и концентрации красителя, метода фиксации, продолжительности окрашивания, рН раствора (нейтральный), температуры воздуха во время окрашивания.
Существуют методики срочного окрашивания мазков во время операции с использованием азура-эози-на (Н.Г. Алексеев, 1957). В последнее время за рубежом для срочного окрашивания во время операции начали использовать методику Diff-Quik (от англ. срочная дифференцировка), при которой препараты изучают влажными без покровного стекла.
Кроме обзорных окрасок мазка можно применять различные дополнительные методики — цитохимические для выявления гликогена, липидов, слизи, амилоида, коллагена, миелина. В мазках-отпечатках био-птатов можно выполнять иммуноморфологические исследования (см. ниже).
Одним из принципов использования любой методики окрашивания мазка является исключение «загрязнения» (в частности, фильтрация красящего раствора) клетками, источником которых могут быть предыдущие мазки. Опытные цитопатологи призывают к осторожности трактовки цитологической картины при обнаружении диагностически значимых клеток, расположенных исключительно на периферии мазка, что характерно для «клеток-плавунов». Ниже приведены общепринятые методы окрашивания.
Методики окрашивания азур-эозиновыми красителями. Различают несколько вариантов окрашивания азур-эозином: методики Гимза, Романовско-го-Гимза, Паппенгейма, Лейшмана (метод приведен в качестве примера).
Окрашивание по Лейшману.
Мазок, высушенный на воздухе, окрашивают в красителе-фиксаторе Лейшмана — 3 мин, промывают водопроводной водой, переносят в основной краситель (40 мл азура, 30 мл эозина, 70 мл дистиллированной воды) на 30-40 мин; мазки промывают водопроводной водой.
Краситель-фиксатор Лейшмана: 2.5 сухого красителя в 1л метанола [созревает 3-4 дня]+азур [1 г сухого красителя в 1 л дистиллированной воды, созревает 3-4 недели]+эозин [1 г сухого кра-сителя в 1 л дистиллированной воды, созревает 3-4 недели].
Методика окрашивания по Папаниколау (R.M. De May, 1996), которая находит все большее применение в отечественной цитологической практике.
| 95 % этанол (фиксатор) | 15 мин |
| 80% этанол | 6-8 погружений мазка |
| 70% этанол | 6-8 погружений мазка |
| 50% этанол | 6-8 погружений мазка |
| Дистиллированная вода | 6-8 погружений до визуального исчезновения следов спирта |
| Гематоксилин Гарриса* нерастворимый | 45 сек |
| Дистиллированная вода | Прополаскать мазок |
| Дистиллированная вода | Прополаскать мазок |
| Дистиллированная вода | Прополаскать мазок |
| 50% этанол | 6-8 погружений |
| Гидрохлорид аммонияNH4OH (1.5% в 70%-м этаноле) | 1 мин |
| 70% этанол | 6-8 погружений мазка |
| 70% этанол | 6-8 погружений мазка |
| 80% этанол | 6-8 погружений мазка |
| 95% этанол | 6-8 погружений мазка |
| OG6 | 1-1/4 мин |
| 95% этанол | Прополаскать мазок |
| 95% этанол | Прополаскать (чтобы стекло не было в спирте) |
| ЕА-50 или ЕА-65 | 3 мин |
| 95% этанол | Прополаскать мазок осторожно |
| 95% этанол | Прополаскать мазок осторожно |
| 95% этанол | Прополаскать мазок осторожно |
| 100% этанол | 6-8 погружений мазка |
| 100% этанол (если большой объем) | 6-8 погружений мазка |
| 100% этанол/ксилол (1:1) | 6-8 погружений мазка |
| Ксилол | 6-8 погружений мазка |
| Ксилол | 6-8 погружений мазка |
| Ксилол | До готовности к заливке |
* Нерастворенный запас, к которому добавить 4 мл ледяной уксусной кислоты на 100 мл краски.
Методика окрашивания гематоксилином-эозином. Высушенный на воздухе мазок фиксируют 96%-м этанолом — 7 мин, окрашивают гематоксилином — 5 мин; промывают проточной водой — 2 мин, дополнительно окрашивают 0.3 %-м спиртовым раствором желтоватого эозина — 1 мин, промывают проточной водой — 2 мин, высушивают.
Гематоксилин: 50г алюмокалиевых квасцов растворяют в 500 мл дистиллированной воды, доводят до кипения, в горячий эаствор помещают 1г гематоксилина, добавляют 500 мл дис-тиллированной воды и доводят до кипения, фильтруют, хранят 3 бутыли с притертой пробкой.
Методика срочного окрашивания мазков по Н.Г.Алексееву. Тонкий мазок, высушенный на воздухе, фиксируют в теплом (40°С) растворе Май-Грюн-зальда — 30 сек; ополаскивают водопроводной водой, окрашивают основным красителем (0.1 %-й раствор взура-эозина — 2:1) — 3 мин, промывают водопровод—ой водой, промокают фильтровальной бумагой.
Гистохимическое и цитохимическое исследование
Определенную помощь в установлении диагноза могут оказать дополнительные методы выявления в мазке гликогена, глюкозоаминогликанов (слизи), жира, коллагена и т.п.
Иммуногистохимическое и иммуно-цитохимическое исследование
В настоящее время широкое распространение получило иммуногистохимическое исследование с помощью моноклональных и поликлональных антител, позволяющих выявить экспрессию опухолевых тканеспецифи-ческих белков. В ряде случаев применение этих методов реально помогает диагностике. Реакцию проводят не только в свежих и архивных гистологических срезах, но и в мазках (иммуноцитохимия). Для анализа используют спектр маркеров — опухоле-ассоциированные антигены, тканеспецифические (белки промежуточных филаментов, коллаген, ламинин), цитоспецифические (гладкомышечный, саркомерный актин), маркеры пролиферации (антиген ядер пролиферирующих клеток — PCNA, белка Ki-67 в ядрах клеток опухоли), гормоны, ферменты, вирусные антигены и т.п.
При использовании иммуногистохимических и им-муноцитохимических методов необходима тщательность методического исполнения и высокая квалификация врача, оценивающего результаты реакции. Доступность, высокая информативность иммуномор-фологических методов подводят к ложному выводу о возможности использовать их в широкой сети медицинских учреждений. Патологоатомическая и цитологическая лаборатории любого лечебно-профилактического учреждения «мечтают» организовать у себя эти исследования. Авторы Атласа считают, что такой подход может серьезно дискредитировать метод, привести к серьезным диагностическим ошибкам, когда неправильный диагноз устанавливают на основании артефактов. Поэтому после первичной цитологической диагностики при необходимости дальнейшей верификации опухоли с помощью рассматриваемых методов больной (или его материалы) должны быть направлены в централизованную лабораторию, специализирующуюся на проведении иммуногистохимических и иммуноцитохимических исследований.