Выдвижению новой идеи, положенной в основании молеку-лярно-генетической теории, предшествовали работы, ведущиеся в двух направлениях. Первое направление работ свидетельствовало о том, что частым предшественником трансформации являются генетические повреждения. Другая информация пришла из вирусологических лабораторий, где изучались ДНК-содержащие опухолевые вирусы (SV40 или вирус полиомы, трансформирующие ретровирусы, например вирус саркомы Рауса). Вирусологи обнаружили, что опухолевый вирус способен переводить культуру клеток в трансформированное состояние (Вайнберг, 1987).
Решающее открытие было сделано в 1910 г. П.Раусом, который показал, что не содержащий клеток фильтрат опухолей цыплят может индуцировать саркому у других цыплят. В 1966 г. в возрасте 85 лет Раус был удостоен Нобелевской премии.
До открытия онкогенов список фенотипических опухолевых свойств был слишком велик. Поэтому возникла насущная потребность выяснить, какие свойства являются первичными, а какие производными, т.е. надо было найти гены плейотропного действия. В связи с этим открытие вирусных генов, обладающих плей-отропным эффектом, т.е. способностью небольшого числа генов вызывать многочисленные фенотипические изменения в раковых клетках, и явилось спасательным кругом в море несвязанных проявлений раковых клеток.
В некоторых вирусах есть всего один ген, ответственный за способность индуцировать опухоли, иногда таких онкогенов несколько. Вирус саркомы, открытый Раусом, относится к группе ретровирусов. Среди опухолевых вирусов это единственные РНК-содержащие вирусы. Для размножения этих вирусов их РНК должна транскрибироваться «обратно» с образованием ДНК. Этот процесс обслуживается ферментом обратной транс-криптазой. В 1970 г. Д.Балтимор, С.Мицутани и Т.Темин обнаружили этот фермент в частицах вирусов типа вируса саркомы Рауса (Бишоп, 1983).
Впервые экспериментально исследовать удалось вирус саркомы Рауса. В 1970 г. Г.Мартин идентифицировал температурочув-ствительные «условные» мутации, изменявшие способность вируса трансформировать клетки в культуре. При рестриктивной (ограничивающей) температуре мутантный ген инактивируется. Ген, открытый Мартином (Калифорнийский университет), называют геном src.
Каким же образом продукт гена src вызывает злокачественный рост? Обнаружилось, что белок ρρβθν-src является протеин-киназой, т.е. ферментом, который присоединяет ионы фосфата к аминокислотным остаткам белков в реакции фосфорилирования. Т.Хантер и Б.Сефтон (Институт биологических исследований Солка) показали, что белок pp60v-src присоединяет ионы фосфата только к аминокислоте тирозину. Как оказалось, фосфорили-рование тирозина — общее свойство ферментов — продуктов онкогенов. Важно отметить, что оно характерно и для регуляции роста нормальных клеток. Фосфорилирование белков — одно из основных средств регуляции активности ферментов.
В случае с белком pp60v-src было предложено два механизма. Фермент может фосфорилировать один белок, включая каскад событий, ведущих к злокачественному перерождению, либо фермент фосфорилирует несколько белков, что вызывает события второго порядка. Хантер и его коллеги показали, что в результате трансформации клетки геном src количество фосфори-лированного тирозина увеличивается в десять раз. Однако ни одна гипотеза не могла объяснить неограниченный рост опухолей, индуцированных геном src (Бишоп, 1983).
В 1972 г. Д.Стахелин, Г.Вармус и М.Бишоп начали изучать «гипотезу онкогена», которую предложили Р.Хьюбнер и Дж.То-даро. Согласно авторам, онкогены ретровирусов являются частью генетического багажа клетки и приобретены посредством вирусной инфекции в ходе эволюции. Онкогены не опасны, пока находятся в состоянии покоя. Активированные канцерогенным фактором, они могут превратить нормальную клетку в раковую.
Исследования методом молекулярной гибридизации выявили, что ген, родственный гену src, имеется у всех позвоночных, т.е. гипотеза Хьюбнера — Тодаро близка к истине. Более глубокие исследования показали, что ген, который был обнаружен у по-люночных, не является геном ретровирусов. Этот клеточный ген назвали c-src. Проблема гена c-src стала еще более загадочной, когда было обнаружено, что ген активен в нормальных клетках, т.е. транскрибируется с образованием информационной РНК, а затем РНК транслируется с образованием белка.
Пытаясь объяснить сходство между онкогенами ретровирусов и их родственными аналогами из нормальных клеток, большинство ученых считают, что онкогены ретровирусов являются копиями клеточных генов. Выяснилось, что все клеточные онкогены обладают злокачественным потенциалом.
Являются ли ретровирусные онкогены просто копиями генов из нормальных клеток и как объяснить действие вирусных генов в инфицированных клетках? Были предложены две гипотезы. По мутационной гипотезе отличия вирусных онкогенов от клеточных предков небольшие и возникли в результате мутаций, происходящих во время копирования клеточных генов с образованием геномов ретровирусов. Гипотеза дозы гена предполагает, что онкогены ретровирусов перегружают клетку, по существу, нормальными белками. С этой точки зрения развитие рака зависит от дозы трансформирующего вирусного белка. Как считает М.Бишоп (1983), клеточные онкогены входят в тонко сбалансированную систему регуляции роста и развития -нормальных клеток. Повышенная активность одного из генов системы может нарушить регуляцию и сдвигать состояние равновесия в сторону неограниченного роста. Заметим, что гипотеза «дозы гена» разрушает основу концепции «противоопухолевого иммунологического надзора» (Бернетта), поскольку исчезает «чужеродность» онкогенов, как предполагается, появляющаяся в результате мутаций, но если нет мутаций, то отсутствует и предполагаемая чужеродность, а иммунитет остается в бездействии.
Таким образом, попытки ответить на вопрос, как поврежденная ДНК может вызвать злокачественный рост, породили концепцию «раковых генов». Раковые гены — это компоненты нормального генома клетки, регуляция которых выходит из-под контроля и усиливается под действием канцерогенов. Канцерогены повреждают онкоген либо другой ген, который в нормальных условиях регулирует активность раковых генов.
Постепенно гипотеза онкогена изменилась: главную роль в ней стали играть клеточные, а не вирусные гены. Как считает М.Бишоп (1983), то, что удалось открыть, может удивить — «оказалось, что процессы, приводящие клетку к раку, в принципе неотличимы от тех, что действуют в нормальной клетке… Бесполезно изобретать средства, угнетающие процессы, которые приводят к злокачественному росту клетки, если те же самые процессы необходимы для их нормального существования». Это замечание очень важно, но в тканевой модели рака оно приняло другую форму выражения, раковые клетки — это стволовые кло-ногенные клетки, обладающие активизированными онкогенами, которые выходят из-под контроля в результате нарушения тканевого гомеостаза.
В настоящее время известно более двух десятков онкогенов (Weiss et al., 1982), выявленных в геноме различных ретровиру-сов. Предполагают два возможных механизма включения инородной генетической информации в состав вирусного генома: 1) присоединение дополнительного участка к уже имеющимся реплика-ционным вирусным генам; 2) замещение части вирусного генома фрагментом, несущим иную функцию. В первом случае ретрови-рус сохраняет способность самостоятельно реплицироваться, но приобретает новые свойства (онкогенность в случае присоединения онкогена). Во втором случае появление онкогенных свойств у ретровируса сопровождается утратой возможности самостоятельно реплицироваться (Киселев и др., 1990).
В последние годы появились работы, посвященные анализу роли онкобелков — продуктов онкогенов в различных опухолях человека. Основываясь на этом анализе, были сделаны следующие выводы (Киселев и др., 1990):
1) прямой зависимости между повышенной экспрессией онкогенов и определенным типом опухоли не существует;
2) исследованные онкогены по частоте экспрессии в опухолях человека делятся на несколько групп — а) «молчащие» или редко регистрируемые онкогены (c-abl, c-src, c-mos, c-erb B), б) умеренно экспрессируемые онкогены (c-myb, c-fms, c-sis), в) часто экспрессируемые онкогены (c-Ki-ras, c-Ha-ras, c-fos) и г) онкогены, активные в большинстве клеток (с-тус);
3) в низкодиффе-ренцированных опухолях экспрессируется большое число онкогенов и с большей эффективностью;
4) спектр экспрессируемых онкогенов в первичных опухолях и метастазах различный.
Как считают Ф.Л.Киселев и соавт. (1990), в настоящее время экспериментальные данные, однозначно подтверждающие появление опухоли у человека вследствие повышенной экспрессии онкогенов, отсутствуют. Существует ряд причин, объясняющих неоднозначность полученных результатов. Во-первых, еще не все онкогены использованы в анализе, во-вторых, в природе могут существовать не идентифицированные пока онкогены. В-третьих, экспрессия онкогенов играет ключевую роль на определенных этапах трансформации, возможно на самых ранних, в то время как опухоль человека становится доступной для анализа на поздних стадиях В-четвертых, не исключено, что экспрессия клеточных онкогенов отражает лишь определенный уровень дифференцировки или роста и не имеет прямого отношения к канцерогенезу.
Отметим, что при лейкозных заболеваниях экспрессия определенных онкогенов в некоторых клетках коррелирует с уровнем их дифференцировки.
Оценивая клинический выход анализа экспрессии онкогенов, Киселев Ф.Л. и соавт. (1990, с. 200) пишут: «… может ли иметь тестирование экспрессии онкогенов какое-либо практическое значение для онкологии, в частности для диагностики?.. Следует отметить, что, несмотря на то что надежды на быстрое выяснение роли этих генов в канцерогенезе в какой-то мере не оправдались, исследования последних лет показали, что работы в этой области могут иметь определенное значение для диагностики и прогноза раковых заболеваний».
В ходе дальнейшего изучения онкогенов были обнаружены гены с противоположной функцией. Их действие в нормальных клетках состоит в том, чтобы подавлять пролиферацию. Если клетка утрачивает их либо они повреждаются, снимаются ограничения роста и размножения клетки. Ключом к механизму действия антионкогенов стали исследования ретинобластомы — рака, поражающего глаза (Вайнберг, 1988). Ретинобласты — это предшественники клеток сетчатки на задней стороне глаза. Как только ретинобласт достигает определенной стадии дифференциров-ки, он перестает делиться, при раке нормальное созревание клеток нарушается.
В 1971 г. А.Кнудсон (Институт рака в Филадельфии) предложил гипотезу, согласно которой мутантные гены у индивидуума могут появляться двумя — путями по наследству или в результате соматических мутаций. Кнудсон заключил, что все опухолевые клетки содержат не один мутантный ген, а два. При семейной ре-тинобластоме первая из двух мутаций присутствует в гене-мишени с момента зачатия. Вторая необходимая мутация может быть соматической. В противоположность этому при несемейной рети-нобластоме обе необходимые мутации возникают локально в одной клетке сетчатки.
Дальнейшие исследования Й.Юниса (Миннесотский университет) с помощью микроскопического изучения хромосом дали новые результаты. Обнаружилось, что в длинном плече (q-пле-че) одной из хромосом, а именно 13, часто бывают делеции: отсутствует та или другая полоса. Корреляции между изменениями в области 13ql4 и ретинобластомой наблюдались слишком часто. К 1983 г. были получены результаты, свидетельствующие о том, что вторая генетическая мишень находится на парной хромосоме 13. Ген хромосомы 13, который, очевидно, участвует в процессе опухолеобразования, был назван Rb (Вайнберг, 1988).
Логично было предположить, что, если вначале в клетке сетчатки имелся один нормальный ген и один мутантный вариант Rb, это могло иногда заканчиваться появлением двух мутантных копий гена. Гипотеза Кнудсона могла быть сформулирована иначе. Мишенями двух «выстрелов», необходимых для возникновения рака, являются две копии гена Rb. Каждое попадание выводит из строя одну копию гена. Дети* получившие от родителей мутантный ген Rb, нормальны, но у них повышен риск возникновения рака. Эта мутация рецессивна, поэтому она проявляется, только если уцелевший аллель гена утрачивается в той или иной клетке сетчатки.
Методом гибридизации была исследована структура хромосомного участка гена Rb. Для 30% препаратов были получены данные, свидетельствующие, что структура одной или обеих копий клонированного гена значительно изменена из-за делеций. Результаты исследований, подтверждающие существование генов — подавителей пролиферации, делятся на 2 группы (Klein, 1987):
1) во многих опухолях с генетической предрасположенностью были обнаружены делеций в хромосомах;
2) в соматических гибридах нормальных и опухолевых клеток преобладал нормальный фенотип. Таким образом, функционирование гена Rb, а именно подавление его функций, связано с возникновением таких опухолей, как ретинобласто-ма, остеосаркома и саркома мягких тканей.
Кроме описанных опухолей существует еще несколько опухолей, ассоциированных с гомозиготной потерей специфического хромосомного локуса, но в которых пока какого-либо супрессор-ного гена идентифицировать не удалось. К ним относятся (Friend et al., 1988): множественные эндокринные неоплазии типа 2 и хромосома 1, меланома языка и хромосома 2, карцинома почки и карцинома легких — хромосома 3, карцинома кишечника, семейный полипоз — хромосома 5, множественная эндокринная неоплазия типа 2а — хромосома 10, опухоль Вильмса, гепатобласто-ма, рабдомиосаркома — хромосома 11, рак протоков молочной железы — хромосома 13, карцинома кишечника — хромосома 17, нейрома слухового прохода и менингиома — хромосома 22.
Таким образом, теперь известны 3 группы генов, участвующие в процессах злокачественного превращения согласно теории онкогена:
1) онкогены,
2) вирусные гены,
3) гены-супрессоры (подавители пролиферации). Однако многие вопросы пока остались без ответа.
Касаясь нерешенных проблем, Ф.Л.Киселев и соавт. (1990, с. 113) пишут: «К сожалению, данные, касающиеся коканцерогенных факторов, носят в основном эпидемиологический характер и практически ничего не известно о механизме действия этих факторов… Даже при наличии в клеточной ДНК… интегрированного вирусного генома, содержащего трансформирующий ген… злокачественный фенотип проявляется только при нарушении работы генов, контролирующих дифференцировку и пролиферацию клеток… Основные вопросы, которые остаются неясными для понимания роли вирусов в этиологии рака, сводятся к вопросам: почему не всегда персистирующий вирусный геном способен осуществить злокачественное перерождение клеток, почему это превращение занимает столь длительный период… какие механизмы контролируют переход от первичной поликлональности к конечной моноклональности?»
Итак, мы рассмотрели основные проблемы молекулярно-гене-тической теории. Как уже говорилось, ряд данных, по существу, разбивают теорию онкогена. Проанализируем аргументы и факты, свидетельствующие против теории онкогена, которые разбивают основу — представление о механизме трансформации. Характерно, что предложенные в теории онкогена механизмы трансформации основаны на необратимых изменениях генома клетки, что предполагает необратимость трансформации. Однако представлению о необратимости трансформации противоречат известные факты, касающиеся нормализации раковых клеток в результате дифференцировки. Даже в самой опухоли часть клеток проходит стадии дифференцировки, включая терминальную диф-ференцировку, теряя в результате этого злокачественные признаки. Это положение доказывают и другие факты. При пересадке ядра опухолевой клетки в нормальную энуклеированную яйцеклетку или в зародышевые клетки на самых ранних стадиях развития возникает нормальное химерное потомство, что подтверждает способность к нормализации опухолевого генотипа.
Механизм трансформации в теории онкогена основан либо на генотоксическом действии канцерогенов, либо на интеграции вирусного генома в геном клетки. Однако трансформирующие факторы роста и гормоны не обладают генотоксичностью, но вызывают трансформацию.
Поскольку все канцерогены обладают либо двойным эффектом (генотоксическим и промоторным), либо только промоторным, то отсюда следует, что общим трансформирующим свойством канцерогенов является не генотоксический эффект, а промоторный.
С другой стороны, изолированные и трансплантированные стволовые клетки, не будучи подвергнуты канцерогенному воздействию, проявляют злокачественный рост. С этой группой фактов коррелируют данные по спонтанной малигнизации клеток при длительном культивировании in vitro, где также отсутствуют канцерогенные воздействия. В теории онкогена эти факты являются парадоксом, и они не имеют рационального объяснения в рамках старой схемы трансформации. С позиции тканевой теории рака приведенные факты получают рациональное объяснение: поскольку стволовые клоногенные клетки обладают полным набором злокачественных свойств, нарушение тканевого контроля приведет к злокачественному росту. При этом активизация онкогенов в стволовых клетках не является результатом генотокси-ческого действия канцерогенов на геном.
Установление тождества между раковыми и стволовыми кло-ногенными клетками при нарушении тканевого контроля позволяет принципиально изменить основу теории рака. Речь идет о новой парадигме опухолеобразования, в основу которой положена тканевая теория канцерогенеза. Мы назвали это изменение основ теории рака парадигмой в том смысле, что оно также касается изменения клинических подходов к терапии опухолей. По существу, тканевая модель является выходом из тупика, в который зашла теория онкогена, например в объяснении механизма гормонального рака или трансформирующих факторов роста. В новой тканевой модели данные хорошо коррелируют между собой, что создает логическую сцепленность между всеми группами данных. Идею необратимого нарушения генома клетки онкогенов как причины рака заменила новая идея — нарушения тканевого контроля, что является причиной неконтролируемого деления стволовых, клоногенных клеток. При рассмотрении альтернативы причины неконтролируемого опухолевого роста — нарушения тканевого контроля или необратимые изменения онкогенов — имеющиеся факты свидетельствуют в пользу тканевой модели. Новая теория позволяет объяснить, почему раковые клетки нормализуются при дифференцировке. Это свидетельствует о том, что механизм трансформации разворачивается по сценарию тканевой теории, т.е. трансформация клетки не обусловлена необратимыми нарушениями онкогенов.
Несмотря на критику теории онкогена в вопросе механизма трансформации, ее заслуга в открытии онкогенов и развитии направления молекулярной онкологии является неоспоримой и составляет революцию в изучении природы канцерогенеза. Учитывая, что центральная идея молекулярно-генетической теории относительно активизации онкогенов как причины злокачественных свойств трансформированной клетки сохраняется в тканевой теории, но в иной форме, можно сказать, что между двумя теориями существует глубокая преемственность относительно центральной идеи. В новой теории сохранилась идея активизации онкогенов, но изменился механизм трансформации; если в теории онкогена она связана с необратимым действием генотоксических факторов, то в тканевой модели трансформация связана с выходом из-под контроля стволовых клоногенных клеток, обладающих активизированными онкогенами и злокачественным фенотипом при нарушении тканевого гомеостаза.
Оценивая современную ситуацию в развитии теории онкогена, И.Ф.Сейц (1990, с.14 — 16) пишет: «В настоящее время миновал пик оптимизма, вызванный открытием онкогенов, исчезли иллюзии… что возможно простое и легкое объяснение онкогенеза как следствия активности одиночных уникальных генов».
Непременным условием как нормальной жизнедеятельности, так и опухолеобразования являются пролиферация и дифферен-цировка. Результаты исследований указывают на способность большинства онкогенов модулировать рост и на их участие в развитии эмбрионов и тканей. Многие продукты c-οη с-генов удалось идентифицировать, доказано их участие в регуляции роста. Некоторые из них оказались рецепторами факторов роста (например, c-erb-B — рецептор эпидермального фактора роста (EGF); c-fmc — рецептор колониестимулирующего фактора; λΐ (CSF-I); c-erb-A — рецептор тиреоидного гормона (ТЗ) или самими факторами роста (например, c-sis-B — цепь тромбоцитар-ного фактора роста (PDGF). Сейц, 1990).
Проанализируем представление о возможной дефектности Φ Ρ как причине трансформации и попытаемся найти аргументы против такого представления. Очевидно, тот факт, что факторы роста действуют опосредованно, через рецепторы на мембране, делает невозможным дефектность самой молекулы ФР, поскольку ФР должен «подойти» к своему рецептору — наподобие взаимодействия между ферментами и субстратом. Иначе говоря, если дефектный ФР вызывает реакцию рецептора, то дефект никак не проявится. Механизм рецепторного связывания, очевидно, действует по принципу «все или ничего», т.е. либо он узнается рецептором или рецептор не реагирует на него. Это напоминает радиоэлектронные схемы защиты от помех и шумов, где лишняя часть сигнала вырезается. К теоретическому обоснованию следует добавить экспериментальные данные, свидетельствующие об отсутствии различий между ФР нормальных и трансформированных клеток (Карпентер, Коэн, 1987; Альштейн, Черепанцева, 1986; Белоусова, 1993).
Открытие трансформирующих факторов роста не является подтверждением теории онкогена, а скорее опровергает ее, поскольку они не генотоксичны, следовательно, ни один из механизмов трансформации в теории онкогена не подходит, так как они основаны на мутациях. С другой стороны, ФР действуют через специализированные, эволюционно выработанные механизмы, что противоречит представлению о некоем чужеродном перерождении в результате изменения ДНК. Это ставит проблему переосмысления принципа механизма трансформации — старое понимание трансформации не объясняет новые факты и входит в противоречие с ними. Если трансформация осуществляется за счет трансформирующих ФР, то отсутствует «чужеродность» раковых клеток, которая должна была бы появиться в результате мутаций, следовательно, разрушается концепция «иммунологического надзора», выдвинутая Ф.Бернеттом, которая в настоящий момент разделяется многими авторами. Предполагаемая «чуже-родность» раковых клеток может появиться в результате мутаций, следовательно, для трансформации необходим генотоксиче-ский фактор как условие перерождения клетки — негенотоксич-ность Φ Ρ и гормонов разрушает эту версию.
Решение проблемы плейотропного эффекта трансформирующих генов в тканевой теории связано с решением проблемы «конвергенции» опухолевых признаков в результате прогрессии. Одно и то же решение удовлетворяет критериям двух разных концепций, которые, как показано в новой модели, связаны между собой. Решение состоит в следующем: поскольку стволовые, клоногенные клетки выходят из-под контроля в результате нарушения тканевого гомеостаза, а они обладают унифицированными признаками, идентичными раковым клеткам, и лишены тканеспе-цифических свойств, то это удовлетворяет, с одной стороны, критериям концепции «конвергенции», а с другой — достигается плейотропный эффект трансформации, т.е. появляется набор злокачественных признаков раковых клеток. Таким образом, в рамках тканевой модели решаются эти две проблемы, одна из которых была поставлена при открытии онкогенов как возможный механизм, объясняющий плейотропный эффект. Однако только в тканевой теории этот эффект получает рациональное объяснение.