В красящих смесях Романовского и сходных с ним прописей Гимзы, Райта, Лейшмана в качестве ядерных краси телей используют тиазины. В их ряду — тионин-анилиновый краситель и его моно-, ди-, три- и тетраметилпроизводные азур С, азур А и азур В, метиленовый синий — широко применяются в цитологических исследованиях как ценные ядерные красители со свойством метахромазии для эксфолиативной и пункционной цитологии, для клеток крови, костного мозга, окрашивания бактерий.
Сочетание тиазинов с красителями эозиновой группы дает известную много вариантность методов. Красители типа Романовского, названные по именам авторов, которые стремились добиться стабильности состава тиазинов (Гимза, Лейшман, Дженнер, Май-Грюнвальд, Мак Нил, Райт и др.), в принципе дают сходные результаты окрашивания.
Результаты окрашивания мазков крови: цитоплазма лимфоцитов окрашивается в светло-синий цвет, их ядра — в цвета от интенсивно пурпурного до фиолетового, ядра моноцитов в более светлый пурпурно-красный, их цитоплазма в мутный голубовато-серый, грануломеры тромбоцитов в красный, гиаломеры — в голубой, гранулы базофилов — в интенсивный сине-фиолетовый цвет, гранулы эозинофилов — в оранжево-розовый, а нейтрофильных лейкоцитов — в цвета от пурпурного до фиолетового. Референтным признается метод Романовского, состоящий из азура В и эозина Y.
Азур-эозиновые красители позволяют четко определять ранние некробиотические изменения в клетках, поскольку обычный светло-голубой оттенок цитоплазмы резко меняется на светло-розовый. В синий цвет обычно окрашиваются ядра, бактерии, риккетсии, тигроид и рибонуклеопротеиды, в голубовато-фиолетовый — гранулы тучных клеток и базофилов, цитоплазма зрелых клеток — от голубого до фиолетового и бледно-лилового цвета. цитоплазма клеток в состоянии некроза и некробиоза — ярко-розовая, секреторные гранулы ацинарных клеток (под желудочной железы, слюнных желез) от розового до красного. Амилоид, фибрин окрашиваются в розовый цвет, цитоплазма мышечных волокон, коллоид щитовидной железы — в серовато-синий, кератин — ярко-голубой. Эритроциты оранжево-красного цвета. Методы на основе азур-эозина широко используются для идентификации клеток воспалительного экссудата.
Окраска мазков по Wright-Giemsa (№ 9990710)
На основе эозинатов полихромного метиленового синего
1. Погрузить предметные стекла в раствор красителя Райт-Гимза на выбранное время (примерно 60 секунд). Не взбалтывать краситель!
2. Осушить или промокнуть свободную часть предметного стекла (или стеклодержатель), чтобы удалить избы ток краски.
3. Погрузить предметное стекло в буферный раствор примерно на то же самое время, что и время в красителе (60 секунд). Увеличение или уменьшение времени пребывания мазка в краске или буфере будет менять окончательный цвет препарата.
4. Осушить или промокнуть свободную часть препарата (или стеклодержатель), чтобы удалить избыток бу фера.
5. Погрузить мазок в раствор очистителя на 2-10 секунд, быстро взбалтывая.
6. Протереть обратную сторону стекла.
7. Высушить окрашенный мазок в вертикальном положении, поставив на адсорбирующую поверхность (напри мер, на фильтровальную бумагу). Не промокать мазок!
8. Нанести каплю масла и исследовать мазок под микроскопом. Результаты: как при окрашивании по Романовскому.
Ускоренный метод Giemsa-Kwik-Diff (№9990700)
Приготовленный мазок высушивают.
Готовят 3 контейнера (сосуды Коплина или кюветы). Наполняют Kwik-Diff раствором № 1 (фиксатор), второй сосуд — раствором № 2, третий — раствором № 3.
1. Погрузить стекла или держатели со стеклами 5 раз (1 секунда на погружение).
2. Дать стечь раствору в сосуд, обсушить край стекла.
3. Погрузить стекла или держатели стекол в раствор № 2,5 раз (одно погружение — 1 секунда). Дать жидкости стечь, обсушить край.
4. Погрузить стекла или держатель со стеклами в раствор № 3 — 5 раз (одно погружение — 1 с). Дать жидкости стечь, обсушить край фильтровальной бумагой.
5. Промыть стекло или держатель со стеклами путем погружения и покачивания в дистиллированной или де-ионизированной воде.6. Высушить на воздухе или использовать теплый воздух сушилки. Покрыть маслом и исследовать. Результаты окрашивания аналогичны представленным выше.
Окрашивание мазков гематоксилином-эозином
Могут использоваться различные виды гематоксилинов: Gill, Harris, кислый и неподкисленный.
1. Фиксация мазков в спирте-эфире или 96% этаноле.
2. Окрашивание в гематоксилине Gill 2 (№ 6765007) — 3-5 минут.
3. Промывание в проточной воде 1-2 минуты.
4. Окрашивание в 0,3% спиртовом растворе эозина Y (Instant, Eosin № 6765040) — 1 минуту.
5. Для сохранения микропрепарата рекомендуется заключение в бальзам после обезвоживания в спиртах. Результаты: ядра клеток — сине-фиолетового цвета, цитоплазма, мышечные волокна — различные оттенки розового цвета, муцины — светло-розового, кератогиалины — ярко-розового цвета.
Окрашивание мазков по Граму для выявления бактериальной флоры
1. Фиксация в пламени горелки мазком вниз при круговых движениях — 3 раза. Остудить.
2. Накрыть покровным стеклом с красителем кристаллическим фиолетовым Грама (№ 9990725) — 1 мин.
3. Промыть стекло до чистой промывной воды деионизированной или водопроводной водой.
4. Накрыть покровным стеклом с красителем йодным реагентом по Граму (№ 9990726) — 1 мин.
5. Осторожно промыть стекло деионизированной или водопроводной водой. Дать стечь.
6. Промыть стекло с обесцвечивающим раствором (№ 9990727) до потери окрашивания.
7. Осторожно промыть стекло деионизированной или водопроводной водой 5—10 с.
8. Накрыть покровным стеклом с красителем Safranin О (№ 9990728), подкрашивать 1 мин.
9. Осторожно промыть стекло деионизированной или водопроводной водой 5—10 с до чистого цвета воды.
10. Дать раствору стечь и высушить на воздухе. Можно осторожно промокнуть фильтровальной бумагой.
11. Исследовать с иммерсией.
Результаты: бактерии темно-фиолетового цвета — грамположительны. Бактерии грам-отрицательные окрашены в розово-красный цвет. Контролем качества окрашивания мазка является сине-фиолетовый цвет ядер лейкоцитов и эпителиальных клеток.
Молекулярно-биологические методы выявления вируса папилломы человека
{Human papiloma virus (HPV) в диагностике заболеваний шейки матки
Тонкослойные препараты — cytospins — полученные на основе жидкостной цитологии, позволяют внедрить но вые методы для микроскопической диагностики, в частности, иммуноцитохимические, для выявления микроорганизмов в мазках из шейки матки.
Выявление группы риска при исследовании цервикальных мазков и дальнейший мониторинг позволяют уловить процесс озлокачествления на самых ранних стадиях и получить лучшие результаты лечения, а обнаружение HPV при пограничных и неясных изменениях эпителия шейки матки — выбрать адекватную тактику ведения больных. Считают, что выявление HPV может стать второй по значимости скрининговой противораковой программой.
Для выявления вируса папилломы человека фирма ЛабМетод предлагает ряд методов.
Иммуноцитохимический метод
Метод обеспечивает выявление возбудителя внутри клеток. В основе метода лежит специфическое взаимодействие антигена и антитела. Предлагается широкая панель антител как для скрининга на вирус папилломы человека, так и для типирования вирусов, поскольку для эпителия шейки матки особенно «опасными» являются 16 и 18 типы. Время исследования: минимально от 2,5 часов, специфичность метода > 80%.
Иммунное окрашивание в стандартном варианте выполняется с использованием рабочего места иммуноморфологаSequenza № 73300001, которое включает камеры для инкубации, панель реагентов, буферы и таймер. Исполь зуют протокол:
1. Используя пластины coverplate №7219950, инкубировать цитопрепараты cytospins, в растворе 0,25% Тритон Х-100, 5% ДMSO в фосфатном буфере 10 минут для усиления проницаемости мембран.
2. Промыть 3 раза в деионизированной воде по 5 минут для удаления детергента.
3. Инкубировать в 1,5-3% растворе перекиси водорода в метаноле — 30 минут.
4. Промыть 3 раза в деионизированной воде по 5 минут для удаления перекиси водорода и метанола.
5. Инкубировать в 10% нормальной сыворотке соответственно вторым антителам при +4 ºС в течение ночи или 20 минут.
6. Инкубировать с антителами против HPV (Papillomavirus 16&18 №Р-160Ю0601) — 30 минут.
7. Промыть в трис-буфере.
8. Обработать вторыми антителами, мечеными FITC — 30 минут.
9. Промыть в трис-буфере.
10. Заключить в среду PERMAFLUOR № 434980.
Исследовать посредством флуоресцентного микроскопа (Nikon E400). Существует возможность оценки результатов в световом микроскопе, если вторые антитела используют с ферментной меткой.
Автомат для выполнения иммунохимических реакций NexES (№ 750-200) — принцип «walk away» — компактная настольная система, от 1 до 25 микропрепаратов за цикл в течение от 60 до 90 минут с выбором из 30 первых антител. Имеются антитела к широкой группе вирусных возбудителей, включая Anti-HPV № 760-2651, герпес Anti-HSVI (№ 250-2749). Anti-HSV II (№ 250-2750). Anti-Parvovirus (№ 760-2663), Anti-RSV, Respiratory Syncytial Virus (№ 250-2825). Заключение готовых микропрепаратов происходит в жидкое покровное стекло.
Автомат NexES идеален для методов оценки гормонального статуса и исследований в онкоморфологии
Метод гибридизации in situ (In situ hybridisation (ISH). отличается высокой специфичностью, около 99%; чувстви тельность его приближается к 95%.
Гибридизация In situ (ISH) позволяет совместить два процесса: выявление специфических нуклеиновых кислот вируса папилломы человека и определение их локализации в единичных клетках. Это многоэтапная процедура, включающая: подготовку биологического материала (приготовление тонкослойных препаратов — cytospins на стеклах, обработанных раствором Histogrip), использование нуклеотидных зондов, иммуноцитохимическое обнаружение зондов, визуализацию меток (например, с помощью микроскопии).
Фирма ЛабМетод предлагает наборы REMBRANDT®
ISH для выявления вируса папилломы человека (№ НКВ18000), вируса герпеса (REMBRANDT® for HSV 1/2 № НКВ18056) методом гибридизации с меткой биотином или дигоксигенином.
Принцип метода — выявления ДНК- или РНК-последовательностей без потери морфологической структуры, для чего используют молекулярные зонды, несущие метку.
Зонды представляют собой короткие молекулы ДНК, комплементарные ДНК-мишени (в данном случае, HPV).Метки, выявляемые иммуноцитохимическим методом, позволяют судить о наличии или отсутствии ДНК-мишени (ви руса папилломы человека). Этот метод обладает высокой специфичностью и до появления ПЦР был самым высоко чувствительным.
Протокол метода гибридизации in situ требует заданного температурного режима. Фирмой ЛабМетод могут быть предложены:
— Водяная баня (№ WB14).
— Термостат (№ INC222).
— Программируемый термостат OmniSlide (№ HB-OS-BB-220) с принадлежностями.
Оценка результатов при использовании светового или флуоресцентного микроскопа по выявлению хромогено-вых гранул или флуоресценции.
Автоматические системы для выполнения гибридизации in situ NexES (№ 850-100) с набором реагентов, кото рые обеспечивают высокий уровень исследования с положительными и отрицательными контролями.
Полимеразная цепная реакция (ПЦР)
ПЦР — метод, в основу которого положен процесс естественной репликации ДНК, осуществляемый в клетках.
ПЦР позволяет обнаружить единственную специфическую молекулу ДНК среди большого количества других молекул вирусного и клеточного происхождения.
Для проведения ПЦР необходимо наличие в реакционной смеси ряда компонентов:
— ДНК-мишени (ДНК, которую необходимо амплифицировать).
— Праймеров — пар олигонуклеотидов, протяженностью от 15 до 30 нуклеотидных пар (нп), комплементарных к соответствующим участкам ДНК-мишени. Корректно подобранные праймеры обеспечивают специфичность и чувствительность тест-системы.
— Taq- полимеразы — термостабильного фермента, достраивающего вторую цепь ДНК по одному из тяжей ДНК-мишени.
— Дезоксинуклиотидтрифосфатов дНТФ — дезоксиаденозинтрифосфат дАТФ, дезоксигуанозинтрифосфат дГТФ, дезоксицитозинтрифосфат дЦТФ и дезокситимидинтрифосфат дТТФ. Эти компоненты используются Taq-полимеразой для синтеза второй цепи ДНК.
— Буферного раствора (БР), обеспечивающего оптимальные условия для реакции.
ПЦР включает в себя три температурных этапа:
— Первый этап состоит из процесса денатурации ДНК, находящихся в образце, в результате денатурации одна двухцепочечная молекула ДНК переходит в две одноцепочечные молекулы. Температурный режим ТР — 92-95 °С.
— Второй этап заключается в гибридизации (присоединении) праймеров к комплементарным участкам ДНК-мишени; этот процесс носит название отжига праймеров. ТР — 55-60 °С.
— Третий этап ПЦР включает в себя синтез второй цепи на одноцепочечной молекуле ДНК-мишени, на которой произошел отжиг праймеров. ТР на этом этапе соответствует оптимальным условиям работы Taq-полимеразы и равен примерно 70-74 °С.
Если трехэтапный температурный цикл многократно повторить (30—40 циклов), то количество амплифицированных молекул ДНК-мишени (ампликонов) достигнет приблизительно 2 (где п число циклов амплификации). Необходимо отметить, что процесс накопления продуктов амплификации идет по геометрической прогрессии лишь определенное число циклов, а затем имеет место эффект «плато», то есть количество ампликонов не возрастает.
Детекцию ампликонов выполняют методами электрофореза или с помощью ДНК-ИФА. В настоящее время на рынке существует система DASH, которая позволяет выявлять ампликоны, используя совершенную систему ДНК-ИФА (дополнительная информация по запросу).
Организация ПЦР лаборатории требует специального оборудования (ламинары, настольные центрифуги, термостаты, пипетманы и т. д.) и специально оборудованных и корректно расположенных помещений (для предупреждения контаминации).
Метод in situ RT-PCR был разработан с целью соединения высокой чувствительности метода реакции об ратно — транскриптазной полимеразной цепной реакции (RT-PCR) с преимуществами исследований in situ, что особенно важно, например, для вирусов с низким уровнем репликации. Как и ISH. in situ RT-PCR состоит из нескольких этапов: подготовка биологического материала, in situ амплификация, обнаружение внутриклеточньи продуктов RT-PCR. In situ RT-PCR
Необходимое оборудование: термоциклер PCR Express (№-HB-PX-B05) со сменным блоком для предметных стекол или самостоятельный прибор Omnislide (№ HB-OS-BB-220), который позволяет целиком решить технологиче кие задачи приготовления образцов.
По вопросам обучения современным методам в клинической цитоморфологии просим обращаться в учебный центр фирмы «ЛабМетод».